שיבוט, ביטוי, קיפול וניקוי חלבונים מהונדסים גנטית המשמשים לטיפול תראפויתי – המצב כיום

שיטות הביולוגיה המולקולרית וההנדסה הגנטית מאפשרות זה יותר משני עשורים יצירת מספר רב של חלבונים, שיש להם שימוש תראפויתי בחיי היום-יום (הורמון גדילה, אינסולין, אינטרפרונים למיניהם, אריטרופויטין וכן נוגדנים הומניים חד-שבטיים). השיטות הנ"ל מאפשרות קבלת כמויות גדולות (קילוגרמים) של החומרים האלה בדרגת ניקיון גבוהה, בצורה הזהה לחומר המקורי ובעלות סבירה יחסית.

השלב הראשון בייצור חלבון מהונדס גנטית הוא עצם השיבוט (Cloning) של המידע התורשתי המקודד לחלבון הנתון(mRNA). מבחינה של מבט היסטורי לאחור, שיבוט הגנים עבר התקדמות רבה, יחסית לסוף שנות השבעים, שבהן החלה דרכה של התעשייה הביוטכנולוגית.

בשנות השבעים, בתחילת הדרך, מקטעים של DNA גנומי או של cDNA, שנתקבלו כתוצאה מביקוע אנזימתי ע"י Restriction enzymes (אנזימי ביקוע), שובטו באתר החיתוךPstI  של הפלסמיד ' zt, pBR322, לאחר שהודבקו אליהם באופן מלאכותי הבסיסים החנקתיים  Gו-C. באופן זה הוכנו ספריות אקראיות של גנים. ספריות אלה נסרקו בזמנם ע"י גלאים ספציפיים שסומנו באמצעות חומר רדיואקטיבי, בכדי לבודד את הגן הרצוי. בהמשך, עם התפתחות היכולת לסנתז DNA מלאכותי, הוכנו מתאמים (Adaptors – Linkers) שהודבקו באמצעות האנזים T4 DNA Ligase ל-cDNA ומקטעים אלה שובטו לאתר הביקוע המתאים בפלסמידpBR322 . באופן זה התקבלו ספריות של cDNA שנסרקו כמתואר למעלה.

עם התפתחות היכולות לסינתזה מלאכותית של DNA הוכנו מקטעי DNA סינתטי אשר הודבקו על פי תכנון מדויק אל מקטע של cDNA שהוכן קודם לכן. בשלב זה כבר נעשה השיבוט על גן שהרצף החלקי שלו היה ידוע, אך מאידך ניתן היה להשלים את החסר על סמך ידיעת רצף החומצות האמיניות של החלבון השלם (ראו המקרה של הגן להורמון הגדילה אצל  חברת Genentech). הקפיצה הבאה הייתה עם השיפור ביעילות הסינתזה של DNA סינתטי והיכולת להרכיב גן שלם סינתטי עם הכנסת שינויים כרצוננו ברצף, כל זאת מבלי לשנות את הקידוד לחומצות האמיניות (ע"י שימוש בטבלת הקוד הגנטי). בהמשך, ועד היום (כאשר הרצף הגנטי של הגנים השונים ידוע מפרויקט הגנום האנושי), מרבית השיבוט של הגנים נעשה ספציפית וישירות למערכת הביטוי באמצעות השימוש בטכנולוגיה של Polymerase Chain Replication (PCR). במקביל, פותחה באותה תקופה היכולת לשבט גנים גם בתאים אנימאליים, כולל אמפליפיקציה של הגנים הנ"ל בתוך הגנום של התא ע"י שימוש באנזים  DHFR וגידול התאים במצע המכילMetathroxate .

כאמור, את שיבוט הגנים ניתן לעשות ישירות ל-DNA הגנומי תוך כדי אמליפיקציה שלו למאות עותקים לתא, או לתוך פלסמיד חיידקי שאף הוא יכול להימצא בעשרות או במאות עותקים לתא חיידקי. כדי לקבל חלבון מהגן המשובט יש הכרח להנדס אותו באופן מדויק למערכת ביטוי. מערכת הביטוי יכולה להיות בחיידקים כדוגמת החיידק E.coli או בתאים אנימאליים (Mammalian cells). הביטוי של החלבון הספציפי יכול להתבצע באופן רציף או להיות מבוקר ע"י כימיקלים ספציפיים (חסר או עודף שלהם במצע הגידול) או כתלות בטמפרטורת הגידול.

את הגן הספציפי ניתן "לתפור" במדויק למערכת הביטוי הנבחרת תוך שימוש בטכנולוגיות השונות: ביקוע אנזימתי, הכנת מקטע של DNA סינתטי, הכנת מקטע ע"י שימוש בשיטת ה-PCR ושיבוט של כל המקטעים יחד, בתנאי שהתכנון מראש היה מדויק.

כאמור, שילוב של כלים מהביולוגיה המולקולרית עם שיטות של הנדסה גנטית בתעשייה הביוטכנולוגית מאפשר לחברות לייצר כמויות גדולות של חלבונים (הורמונים, אנזימים, פקטורי גדילה, תרכיבים ונוגדנים חד-שבטיים) בעלי פעילות ביולוגית לשימוש תראפויתי ובדרגת ניקיון גבוהה. לאחרונה יש לחץ הולך וגדל על החברות הפארמצבתיות מצד רשויות הבריאות הממלכתיות ומצד חברות הביטוח הרפואי להוזיל את עלות התרופות. ללחץ זה תהיה ללא ספק השפעה על מחירן והדבר יהיה בעל משמעות גדולה יותר לגבי הפיתוחים הגנריים. לפני החברות עומד האתגר לשפר משמעותית את סה"כ תהליכי הייצור על מנת לאפשר את ההוזלה, ואת זאת ניתן להשיג ע"י מספר צעדים:

א. שיפור היעילות בשלבים השונים של תהליך הייצור;

ב. בחירה במערכת ביטוי וייצור אופטימלית;

ג. הורדת עלויות הייצור.

את השיפור ברמת ההתבטאות של החלבון במערכת הביטוי הנבחרת ניתן להשיג באמצעות: שינויים בפקטוריים מולקולריים; הכנסת שינויים גנטיים בתא המאחסן שמשמש כאמצעי ייצור; הכנסת שינויים ואופטימיזציה של מצע הגידול ותנאי הגידול.

הרשימה הבאה מגדירה מספר פקטורים מולקולריים שלהם השפעה משמעותית על רמת ההתבטאות של חלבונים מהונדסים גנטית בחיידקים:

כפי שצוין קודם, ישנן מערכות ביטוי רציפות ומערכות ביטוי מבוקרות. לכל אחת ממערכות אלה יתרונות וחסרונות משלה.

מערכות ביטוי רציפות: החלבון הנוצר באופן זה מצטבר באיטיות באופן רציף ושומר על מסיסותו. כתוצאה מכך, במרבית המקרים, הוא מתקפל במרחב (מבנה שניוני ושלישוני) באופן נכון ולכן הפעילות הביולוגית שלו מלאה. התבטאות כזו יכולה להתאים לחלבון שהוא חסר רעילות למערכת התאית בה הוא מיוצר. המגבלה במערכת זו היא העובדה שרמות הביטוי נמוכות מאוד (בסדר גודל של עשרות בודדות של מיליגרמים לליטר תסיסה של חיידקים).

מערכות ביטוי מבוקרות: החלבון במערכות אלו נוצר רק כאשר ניתנת ההרשאה. החלבון נוצר אפוא בכמויות גדולות (בסדר גודל של גרמים בודדים לליטר תסיסה של חיידקים) ובאופן מהיר (תוך 2-3 שעות). כתוצאה מההצטברות המהירה של החלבון, הוא נוטה במרבית המקרים לעבור אגרגאציה ולשקוע בגושים כאשר הוא חסר פעילות ביולוגית. ניתן להשתמש במערכות מבוקרות לגבי חלבונים שיש להם רעילות למערכת התאית בה הם מיוצרים, אך חייבת להיות בקרה מוחלטת על תנאי הגידול.

מרבית מערכות הביטוי הן בחיידקים והן בתאים אנימאליים מקורם בנגיפים (בחיידקים בקטריופאג'ים). הדבר נובע מהעובדה שבמהלך האבולוציה סיגלו לעצמם הנגיפים יכולת להשתלט על מערכת הסינתזה של חלבוני התא המאחסן ולייצר בפרק זמן של פחות משעה כמויות גדולות של חלבוני הנגיף. בשיטות ההנדסה הגנטית מנצלים יכולות אלה ומערכות בקרה נגיפיות (פרומוטרים) משמשות לצורך ביטוי החלבון הרצוי בכמויות גדולות.

אחת המערכות הנמצאות בשימוש נרחב לייצור חלבונים רקומביננטיים בחיידקים שבהם קיים פרומוטור תחת בקרת טמפרטורה היא מערכת שמקורה בבקטריופאג' λ (הלאמבדא). המערכת מורכבת ממרכיבים של לאמבדא שהונדסו לתוך התא המאחסן, החלבון (N) והחלבון הרפרסור (Repressor CI) וממרכיבים של לאמבדא הנמצאים על הפלסמיד. בתנאי גידול בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס נוצר רפרסור פעיל, שנקשר למערכת הבקרה הנמצאת על הפלסמיד ומונעת, ע"י עצם הקישור, את יצירת mRNA. כפועל יוצא אין כל סינתזה של חלבון. בתנאי גידול בטמפרטורה שמעל 37 מעלות צלזיוס נוצר רפרסור בלתי פעיל, שאינו נקשר לפרומוטור (מערכת הבקרה), ועל ידי כך מאפשר את התקשרות האנזים RNA Polymerase וסינתזת mRNA, ובהמשך סינתזת חלבון בכמויות גדולות (מספר גרמים לליטר תסיסת חיידקים) תוך פרק זמן קצר (עד 3 שעות מזמן העלאת הטמפרטורה).             
               

מלבד מערכת הבקרה, שיש לה חשיבות רבה לגבי יעילות ההתבטאות של החלבון המהונדס גנטית בחיידקים, ישנם מספר גורמים שאף להם יש השפעה מצטברת על יעילות הביטוי. אחד הגורמים הללו הוא הרצף של הבסיסים הנמצא לפני תחילת הגן שאותו רוצים לבטא ומאחורי מערכת הבקרה. רצף זה משמש להכרה וקישור של הריבוזומים אל ה-mRNA (הריבוזומים הם אותם מרכיבים של התא המאפשרים את סינתזת החלבון בפועל) והוא ידוע בשם Ribosomal Binding Site (RBS) . לגבי רצף זה נקבע קונצנזוס של הבסיסים וכן רצף הבסיסים הנוספים בינו ובין נקודת ההתחלה לסינתזה, ה-Initiation Codon – ATG. רצף זה הוא בעל השלמה עם הקצה ה-'3  של ה-16s Ribosomal RNA, וניתן להבחין בו בהבדלים בין המערכות הבקטריאליות לבין המערכות התאיות האנימאליות, כפי שמראה הטבלה הבאה.

בכדי להימנע מסינתזה שגויה של חלבון וכן מירידה ברמת הביטוי, יש גם הכרח להימנע בזמן התכנון ממספר גורמים נוספים הקשורים לרצף של הבסיסים המהווים את יחידת הביטוי. אחד מהם הוא להימנע מנוכחות רצפים שהם RBS Like בתוך הקוד הגנטי המקודד לחלבון, שכן קיימת אפשרות תיאורטית ליצירת שגיאה בלתי רצויה ע"י התחלת סינתזת חלבון נוספת מנקודה זו. כמו כן יש להקפיד בבחירת רצף הבסיסים המקודדים לחומצות האמיניות השונות, מכיוון שהשימוש בקודונים של חלק מהחומצות האמיניות שונה משמעותית בחיידקים מאשר בתאים אנימאליים. לדוגמה: הקוד  AGGלחומצה האמינית ארגינין נמצא בשימוש נרחב בתאים האנושיים, בעוד שבחיידקים השימוש בו הוא בשיעור של פחות מ-2%. כמו כן יש להשתמש בקודונים שיקודדו לאותו רצף של חומצות אמיניות אך ימנעו היווצרות מבנים דמויי Stem and Loop, מפני שהיווצרות מבנים מעין אלה גורמת לירידה ברמת ההתבטאות.
  

את החשיבות הרבה שיש לרצף הבסיסים שבין מערכת הבקרה לבין נקודת ההתחלה ניתן לראות בטבלה הבאה. לעתים, שינוי בבסיס אחד בלבד ברצף זה, כדוגמת השינוי הקיים ביןMAX2  לבין MAX3, גורם לשינוי בשיעור שבין 0.1% ל-19% בהתבטאות. שינויים בהתבטאות נגרמים גם כאשר משנים קודונים מ-A-T לכיוון של G ו- Cבעמדה השלישית של הקודון (ראו פלסמיד B1).
  

הכותב ד"ר אביגדור לבנון- לשעבר סמנכ"ל למחקר, ביוטכנולוגיה כללית (ישראל) בע"מ, קרית ויצמן, רחובות