אנא סובבו את הטלפון שלכם.
השיטה לשכפול עותקים רבים של DNA או RNA ומדידת כמויות מדויקות של חומר גנטי בדגימה הזניקה קדימה את המחקר הביולוגי, את ההנדסה הגנטית ואת הזיהוי הפלילי.
ה-PCR, ראשי תיבות של Polymerase Chain Reaction ובעברית תגובת שרשרת של האנזים DNA פולימראז, היא שיטה בביולוגיה מולקולרית, שנועדה לייצר כמות גדולה מקטעי DNA מסוימים – כלומר כאלה שרצף הבסיסים שלהם כבר ידוע לנו, או לפחות חלקו. DNA היא מולקולת פולימר – שרשרת ארוכה המורכבת מארבעה סוגים של בסיסים חנקניים, או נוקלאוטידים, שאפשר להתייחס אליהם כארבע אותיות של הקוד הגנטי. הבסיסים מסומנים באותיות A ,G, C ו-T. אחת התכונות המיוחדות של מולקולת ה-DNA היא שהיא בעלת מבנה של סליל דו-גדילי – כלומר שתי שרשראות נגדיות זו מול זו, עם חוקיות קבועה. מול A בשרשרת האחת תמיד תבוא האות T בשרשרת הנגדית, ומול G תמיד תבוא C. החוקיות הזו מאפשרת שכפול מדויק של הסליל הכפול במנגנון שבו הסליל נפתח לשני הגדילים, ואנזים בשם DNA פולימראז מייצר על גבי כל אחד מהם את העותק המשלים. חשוב לציין שה-DNA פולימראז מסוגל רק להאריך DNA קיים, ולכן האנזים נעזר בפיסת DNA קצרה הנקראת תַחַל (primer באנגלית) שתספק לאנזים נקודת התחלה להארכת ה-DNA.
PCR רגיל
בשיטת ה-PCR שפיתח קארי מוליס (Mullis), ואף וקיבל על כך פרס נובל בכימיה, מנצלים את מנגנון הכפלת ה-DNA. לצורך כך, יש לייצר שני תחלים משני כיוונים מנוגדים של מקטע ה-DNA שמעוניינים לייצר. בתאים, אנזים בשם פְּרימאז מייצר את התחלים. במעבדה אפשר לייצר אותם בצורה כימית, ויש חברות ביוטכנולוגיה שמתמחות בייצור תחלים כאלה בכל רצף אותיות לפי הזמנה. אורך התחלים הוא בדרך כלל 25-18 אותיות. כלומר, בשביל PCR צריך לדעת לכל הפחות את רצף האותיות של שני מקטעים קצרים משני צדי המקטע שרוצים לייצר בכמות גדולה.
לצורך ביצוע ה-PCR, שמים במבחנה את ה-DNA של הדגימה, לדוגמה מתוך דגימת דם מזירת פשע. מוסיפים אנזים DNA פולימראז, את שני התחלים, תערובת של ארבעת הבסיסים החנקניים, ותמיסה המכילה מלחים וחומרים אחרים העוזרים לאנזים לפעול. כדי שהאנזים יתחיל לשכפל, צריך להפריד את הסליל הכפול של הדגימה. בתאים יש אנזימים שפורמים את הסליל הכפול. אולם במעבדה מחממים את הדגימה ל-95 מעלות צלזיוס. שלב זה נקרא פְּרימה, או דנטורציה (denaturation). טמפרטורה כזו תהרוס את רוב האנזימים. אולם ב-PCR משתמשים באנזים שמקורו באורגניזמים שחיים במעיינות חמים, כמו החיידק Thermus aquaticus, ובקיצור Taq, שיכולים להתקיים גם בטמפרטורות של 100 מעלות ויותר, והאנזימים שלהם מותאמים לפעול גם בטמפרטורות גבוהות.
השלב הבא הוא שלב האיחוי (annealing), שבו התחלים נקשרים ל-DNA. לצורך כך, מקררים את הדגימה ל-50 עד 65 מעלות צלזיוס. בחירת טמפרטורת האיחוי הנכונה היא קריטית: בטמפרטורה גבוהה מדי התחלים לא ייקשרו ל-DNA. בטמפרטורה נמוכה מדי הם עלולים להיקשר גם למקומות אחרים ב-DNA שאינם תואמים לחלוטין את רצף האותיות שלהם. בחירת הטמפרטורה נקבעת בעיקר לפי הרכב האותיות של התחל, כשכלל הבסיס הוא 2 מעלות על כל A או T ו-4 מעלות על כל G או C, אולם יש להתחשב גם בגורמים אחרים כמו ריכוז המלחים או האפשרות ליצירת דו-גדיל של התחל עם עצמו או עם התחל השני, למקרה שהרצפים שלהם משלימים.
השלב השלישי נקרא הארכה (elongation), ובו מעלים שוב את הטמפרטורה, לרוב ל-72 מעלות צלזיוס שבה האנזים פולימראז מתפקד באופן הטוב ביותר. בשלב זה האנזים מאריך את מקטעי ה-DNA מהתחלים. משך זמן ההארכה תלוי באורך מקטע ה-DNA שרוצים להגביר את כמותו, עם כלל בסיס של בין חצי דקה לדקה על כל 1000 אותיות. בשוק הביוטכנולוגיה קיימים עשרות אנזימים שונים ל-PCR עם מהירויות שונות, טמפרטורות פעולה שונות, יכולת להתמודד עם מקטעים ארוכים במיוחד, עד אפילו 20 אלף אותיות, וגם יכולת שונה להימנע מטעויות שכפול וליצור מוטציות.
שיטת ה-PCR מבוססת על סבבים של פרימה-איחוי-הארכה, כשכל סבב מכפיל את כמות ה-DNA פי שניים. כך, לאחר שני סבבים מקבלים כמות גדולה פי ארבעה של ה-DNA שהיה לנו בהתחלה, אחרי עשרה סבבים – פי 1024 (2 בחזקת 10), ואחרי 40 סבבים – פי טריליון וקצת (2 בחזקת 40).
שכפול RNA
שיטת RT-PCR (קיצור של reverse-transcription-PCR) היא שיטה ייצור כמות גדולה של מקטעי RNA מסוימים. מכיוון שאנזים DNA פולימראז לא יכול לשכפל RNA, יש צורך לתעתק את ה-RNA ל-DNA. זה נעשה בעזרת האנזים רוורס טרנסקריפטאז (Reverse Transcriptase), שמקורו ברטרו-וירוסים, דוגמת HIV. אלה נגיפים שהחומר הגנטי שלהם הוא RNA, והם משתמשים באנזים הזה לייצור עותק DNA של הגנום שלהם, וכך להחדיר אותו לגרעין התא ולגנום של התא המאכסן.
במעבדה משתמשים באנזים לייצר תעתיק DNA של מולקולות ה-RNA. התוצר מכונה DNA משלים הוא בקיצור cDNA. אפשר לייצור תעתיק של מולקולת RNA מסוימת בעזרת תחל מתאים, אולם לרוב מייצרים תעתיק של כל מולקולות ה-RNA בדגימה, באמצעות תערובת אקראית של תחלים (random primer) – אלפי גרסאות של תחלים בעלי רצף אחראי באורך שש אותיות. לאחר ייצור ה-cDNA, אפשר להשתמש בו כתבנית עבור PCR רגיל.
Real-time PCR
PCR בזמן אמת, המכונה גם PCR כמותי ובקיצור RT-PCR או qPCR, זו שיטה שמאפשרת למדוד במדויק כמויות של מקטע מסוים של DNA טבעי או cDNA ולהשוות בין דגימות. בשיטה זו, התמיסה מכילה גם חומר צבע שזורח באור פלואורסצנטי רק כאשר הוא נקשר לDNA דו-גדילי. בשיטת qPCR, משתמשים במכשיר PCR מיוחד שמודד את עוצמת האור הפלואורסצנטי בכל סבב, בסוף שלב ההארכה ולפני שלב הפרימה של הסבב הבא. כך אפשר להשוות כמויות DNA בין דגימות, ואם משווים את עוצמת האור גם לדגימה עם כמות ידועה, אפשר לחשב כמה DNA היה בדגימה המקורית. כמות ה-DNA שמיוצרת מנוטרת בכל סבב עד לסבב ה-40. בדרך כלל, לא בודקים מעבר לכך, מכיוון שעד לסבב ה-40 כבר אמורים לזהות תוצר PCR שהתחיל ממולקולה בודדת בדגימה.
שיטה נוספת נקראת TaqMan (שילוב של Taq ו-Pacman). בשיטה זו, במקום צבע פלואורסצנטי, מוסיפים מקטע DNA קצר שמתיישב באמצע החלק שרוצים לשכפל בכמות גדולה ב-PCR. מקטע זה מחובר בצד אחד לצבע פלואורסצנטי, ובצידו השני למולקולה שמונעת את הפלואורסנציה. כאשר הפולימראז מאריך את ה-DNA מהתחלים, הוא מסיר את המקטע הנוסף, ומפרק אותו. כך משתחרר הצבע הפלואורסצנטי. שיטה זו נחשבת יותר מדויקת מ-qPCR רגיל שכן רק אם נוצר המקטע הנכון ב-PCR יתקבל האור הפלואורסצנטי, לעומת השיטה הרגילה שבה נקבל אור גם אם נוצר מקטע לא-רצוי.
כשרוצים להשוות את כמות ה-DNA (או RNA) בדגימה מסוימת ביחס לאחרות, קובעים סף עוצמת אור כלשהו, ובודקים באיזה סבב הדגימה הגיעה לאותו סף אור. לדוגמה, בדגימה שהגיע לסף בסבב 20 יש פי 1024 (2 בחזקת 10) יותר DNA מאשר דגימה שהגיעה לאותו סף בסבב 30.
שיטת qPCR היא זו ששימשה לבדיקות ה-PCR לקורונה, לזיהוי מולקולות RNA של הנגיף בדגימות של חולים, או בניטור RNA של הנגיף בביוב.
Digital PCR
שיטת PCR דיגיטלי (dPCR) מדויקת אף יותר מ- qPCR להערכה כמותית של ה-DNA בדגימה. השיטה מבוססת גם היא על מולקולה פלואורסצנטית. אולם בעוד שב-qPCR האור הנפלט נמדד מכל הדגימה, ב-dPCR הדגימה עוברת ערבוב עם שמן ויצירת אלפי או מיליוני בועיות נפרדות שבכל אחת ישנה תגובת PCR נפרדת. בכל סבב, נמדדת רמת הפלואורסנציה של כל אחת מהבועיות בנפרד, מה שמאפשר לחשב, באמצעות מודלים סטטיסטיים, כמה מולקולות DNA דו-גדילי היו בתחילת כל סבב.
הכנסת מוטציות באמצעות PCR
מכיוון שהגברת כמות ה-DNA נסמכת על תחלים, אפשר להשתמש בתחלים עם תוספות או שינויים. ככל שמספר הסבבים יעלה, כמות ה-DNA שנוצר ב-PCR תעלה פי אלפי ואף מיליוני מונים על פני ה-DNA המקורי. כך, לדוגמה, נפוצה במיוחד השיטה להוסיף בקצוות של התחלים אתרי חיתוך של אנזימי הגבלה שמשמשים להנדסה גנטית. שיטה זו מקלה על הכנסת מקטע ה-DNA הרצוי ליעדו בשלבים הבאים. דרך נוספת להכניס שינויים היא באמצעות שימוש בתחלים עם שינוי גנטי קטן, ב-PCR על DNA מעגלי, המכונה פלסמיד ומשמש רבות בהנדסה גנטית.
לסיכום, בזכות היותה פשוטה וזולה, שיטת ה-PCR הקפיצה קדימה את כל המחקר הביולוגי, ובייחוד בתחום הביולוגיה המולקולרית, הגנטיקה, והזיהוי הפלילי. גם 40 שנה לאחר שפותחה, השיטה המקורית ושכלוליה הן עדיין בין השיטות השכיחות ביותר במעבדה הביולוגית.
מאת: דר' גל חיימוביץ'
באדיבות מכון דוידסון לחינוך מדעי, הזרוע החינוכית של מכון ויצמן למדע
https://davidson.weizmann.ac.il/
