איתור חומרים בעזרת הטבעה מולקולרית

ההתפתחות הטכנולוגית דורשת שיטות אבחון, זיהוי וגילוי מדויקות, סלקטיביות, מהירות, וזולות. גלאים ביולוגיים, כגון נוגדנים ואנזימים, משמשים תדיר ככלים אנליטיים במעבדות מחקר וברפואה, הודות לרגישות ולייחודיות (סלקטיביות) הגבוהה  שלהם. הבסיס לגלאי ביולוגי הוא יכולת הקישור והזיהוי  שלו בין מולקולה אותה אנו מעוניינים לגלות לבין אתרי קישור ספציפיים. הבעיה העיקרית של גלאים מסוג זה היא חוסר היציבות לאורך זמן של האנזים ורגישות לתנאי הסביבה המגבילים את תוחלת השימוש ואת תנאי השימוש בהם. במהלך הניסיונות לייצר גלאים מלאכותיים, פותחה שיטת ההטבעה המולקולרית – MIP  (Molecular Imprinting Polymer), עליה נרחיב בכתבה זו.

שיטת ההטבעה המולקולרית  מבוססת על קבלת מטבעים למולקולות נבחרות. ביצירת MIP אנו משתמשים בעיקרון של "מנעול ומפתח", המחקה זיהוי מולקולרי טבעי,  כאשר במקרה שלנו אנו בונים מנעול קשיח סביב המפתח, כדי להשתמש במנעול ללכידת "המפתחות הדומים" בהמשך. לאחר חילוצה של מולקולת המטרה מן הפולימר נותר חלל הדומה למבנה המולקולה המוטבעת.

התהליך המוצג בציור מס' 1 מתחלק למספר שלבים: בשלב הראשון, חלקי ה"מנעול" (גם דומים וגם שונים) מעורבבים יחד עם המפתח המולקולרי, ויוצרים ביניהם קומפלקס. את הקומפלקס הנוצר "מדביקים" (מפלמרים) בעזרת חומרים מצלבים, בכדי ליצור "מנעול" יציב שלא יתפרק בקלות. בהמשך, אנו מקבלים את הפולימר – MIP מוכן עם מולקולת ההטבעה – כש"מפתח תקוע" בתוכו. בסיום, מחלצים את המפתח המולקולרי מן המבנה הקשיח שהוכן בשלב הקודם, כדי ליצור "מנעול" סלקטיבי עבור ה"מפתח" המקורי.

קיימות שתי שיטות עיקריות ליצירת פולימר בעל הטבעה מולקולרית: מבנה של מולקולות סביב המולקולה המוטבעת, תוך יצירת קשרים לא קוולנטיים עם המולקולה המוטבעת, כגון קשרים הידרופוביים וקשרי מימן, או בעזרת קואורדינציות מתכות. דוגמאות לשימוש בשיטה זו ניתן למצוא ביצירה של MIP עבור מולקולת מורפין בשיטה לא קוולנטית, וביצירת נגזרות אימידזול באמצעות קואורדינציה עם יוני מתכת (Cu+2). השיטה השנייה מתבססת על סידור מקדים בין חלקי הקומפלקס ונעשית באמצעות קישור קוולנטי הפיך בין מולקולת המטרה לבין מונומר פונקציונלי. בשיטה זו מכינים מטבעים למולקולת כולסטרול.

במהלך 30 השנים האחרונות הוצע מגוון רחב של שימושים בהטבעה מולקולרית, מלבד השימוש העיקרי של איתור וזיהוי חומרים. השימושים שהוצעו כוללים: הפרדות ובידודים של חומרים (למשל הפרדות כיראליות), חיקויי קישור נוגדנים וקולטנים, כגון קישור תחרותי של ליגנדים למטרות דיאגנוסטיקה, וחיקויי קטליזה של אנזימים. המולקולות המוטבעות כוללות: תרופות, חומצות אמינו, קרבוהידראטים, פרוטאינים והורמונים.

נבחר בהורמון  17-β-estradiolלהדגמת חשיבות שיטת ההטבעה הפולימרית. כיום קיים ביקוש רב לניטור רמות האסטרוגנים בדם. המודעות לסכנות בטיפול ההורמונלי החלופי HRT (hormone replacement therapy) והחשיפה להורמונים באופן כללי גדלו מאוד בשנים האחרונות בעולם המערבי, כאשר עיקר המטופלות הן נשים בגיל המעבר. חוסר אסטרוגנים בדם, השכיח בגיל זה, גורם לאיבוד עצם, לשינויי התנהגות, לעלייה בסיכון לחלות במחלת לב ועוד. לעומת זאת, במקרה של רמות גבוהות מן הרגיל, הנובעות מעודף ייצור אסטרוגנים על ידי הגוף או מקבלתם בצורת תרופות (כפי שקורה ב-HRT), עלולות להיגרם תופעות לוואי, כמו עלייה בלחץ הדם, התפתחות סרטן השד וסרטן רירית הרחם, דילול רקמת העצם ועלייה בסיכון להתקף לב. מכאן החשיבות לניטור רמות האסטרוגן בדם, לצורך שמירה על רמה מיטבית של ההורמון. כמו כן, בדיקות אלה חייבות לענות על מספר קריטריונים, כמו דיוק ומהירות בקבלת התוצאות.

כיום נמדדות רמות ההורמון 17-β-estradiol בשיטות אימונולוגיות (Immunoassays), בשיטות כרומטוגרפיות (HPLC עם גלאי אלקטרוכימי), ובעזרת ביוסנסורים. שיטות אלו מסוגלות לגלות ריכוזים נמוכים מאוד של ההורמון (15-500 pg / ml), אך לוקות בחוסר דיוק, בעיקר עקב הדמיון הכימי הרב שבין הסטרואידים השונים. לשם הדגמה, במחקר שבדק את רגישות הבדיקות שנערכו בארבע מעבדות מחקר אנדוקריניות שונות בארצות הברית נמצא, שאחוז טעות של דגימות אסטרוגן ואסטרדיול על ידי radioimmunoassay היה גבוה מ-.25% לעומת זאת, ביוסנסורים העושים שימוש ב-MIP מצליחים לגלות אמנם רמות 17-β-estradiol של ,30-1200 µg אך בצורה סלקטיבית משאר החומרים, וזאת בהשוואה לכל השיטות הידועות.

לפולימרים מוטבעים יתרון נוסף: אפשר להטביע פולימרים גם בחומרים שקשה או אי-אפשר לייצר נגדם נוגדנים טבעיים. חומרים כאלה הם, למשל, תכשירים המדכאים את מערכת החיסון או מולקולות קטנות שאינן אימונוגניות. כך, לדוגמה, פותח לאחרונה פולימר מוטבע שאפשר להשתמש בו לתבחין רדיואימוני לקביעה כמותית של התרופה ציקלוספורין A (cyclosporin A), המדכאת את תגובת הדחייה של שתלים. גם כאן נמצאה התאמה טובה בין שיטה זו לשיטה בה משתמשים בנוגדן חד-שבטי.
 
בדיקות אימונולוגיות ימשיכו להיות בזמן הקרוב שיטות הבדיקה המובילות, אך כבר היום ישנן שיטות נוספות שניתן להיעזר בהן. שיטת ההטבעה אמנם אינה מסוגלת עדיין לגלות חומרים בריכוזים נמוכים כמו השיטה האימונית, אך מציגה מספר יתרונות, כמו: סלקטיביות ודיוק, ללא מתחרים, בחומר הנבדק, טעויות דגימה זניחות, יכולת לייצר נוגדן מלאכותי לחומרים שלא ניתן לייצר עבורם נוגדנים, ויציבות כימית גדולה לאין שיעור מכל שיטה אחרת – וכל זאת בעלות נמוכה.

הכותבים- המחלקה לכימיה תרופתית וחומרי טבע, ביה"ס לרוקחות, האוניברסיטה העברית

מקורות:

1. Mosbach et,al, Drug Assay Using Antibody Mimics Made by Molecular Imprinting Nature; 361: 645-647, 1993
2. Rachkov A et.al, Fluorescence detection of beta-estradiol using a molecularly imprinted polymer, Analytica Chimica Acta; 405 (1-2): 23-29, 2000