כלים ושיטות לפיתוח תרופות על בסיס של מולקולות מטרה (Target oriented) באמצעות תכנון מוקדם (Drug desig

משך הזמן הדרוש כיום לפיתוח תרופה חדשה ולהכנסתה לשוק הוא כ-10 שנים בממוצע והעלות היא כ-500 מיליון דולר. לכן, להכנסתן של טכנולוגיות שישפרו וייעלו את תהליכי הפיתוח יש ערך כספי משמעותי לתעשייה הפרמצבטית. ואמנם בשנים האחרונות חל שיפור משמעותי בתהליכי הפיתוח עם הכנסתן של תוכנות ואמצעי מחשוב לתכנון מוקדם -Drug design. ככל שתהליך זה יעמיק, יש לצפות להכנסתן של תרופות חדישות ויעילות, עם פחות תופעות לוואי, שיפותחו תוך זמן קצר יותר ובעלויות קטנות יותר מאשר היום.

לפני סיום קביעת רצף ה-DNA של הגנום האנושי, פיתוח תרופות בתעשייה הפרמצבטית והביוטכנולוגית התמקד במחקרים בסיסיים, שמרביתם התבצעו במוסדות מחקר אקדמיים. המחקרים הללו תרמו להבנתם של מנגנוני הפעולה, הפעילות הביולוגית והקשר הנסיבתי להתפתחות המחלה. בהתבסס על ממצאים אלה, פיתחה התעשייה כלים נוספים כדוגמת High Throughput Screening (HTS), שבעזרתם נמצאו מולקולות Leads – מולקולות בעלות זיקה וספציפיות למולקולות מטרה(Targets) . ממולקולות leads אלה נעשה בסופו של דבר פיתוח של מולקולות ה-drug. כיום, עם סיום הפרויקט של קביעת רצף ה-DNA של הגנום האנושי, גישת הפיתוח משתנה והופכת למונחת מטרה -Target oriented.

רצף הגנום של ה-DNA הוא כיום נחלת הכלל, ולכן החל מירוץ בין החברות השונות למציאת מולקולות מטרה שיש להן מעורבות ישירה במנגנון גורם המחלה, ובהמשך לזיהוי ובידוד מולקולות leads אפקטיביות.

כיום עומדים לרשותנו אלפי גנים, שאחדים מהם עשויים לשמש מולקולות מטרה שכנגדן יימצאו מולקולותleads , שחלקן יפותחו בהמשך לתרופה. גנים אלה צריכים לעבור דרך מסננת שתברור מתוכם את המבטיחים ביותר (druggable targets). מי יהיו המרוויחים הגדולים מתחרות זו? אותן חברות שישכילו לפתח טכנולוגיות חדשות, להטמיע אותן בשלבי הפיתוח שלהן ולפתח באמצעותן תרופות בפרק זמן קצר יותר ובעלות נמוכה יותר.

משימה זו מצריכה שילוב של תחומים שונים (כימיה, כימיה רפואית, ביולוגיה, פיסיקה, מחשבים ומתמטיקה), כוח אדם מיומן ומקורות מימון ניכרים. התחרות למציאת מולקולות מטרה אפקטיביות היא קשה והמירוץ רצוף באי-ודאויות. אבל מההיבט הכספי, פלח השוק עצום ולכן מצדיק את המאמצים והמשאבים הכספיים הגדולים המוזרמים כיום ע"י החברות הפרמצבטיות בעולם.

מרבית החברות מתמקדות בפלח השוק של פיתוח תרופות נגד מחלות ממאירות, בגלל הקלות היחסית בהוכחת ההיתכנות בניסויים הקליניים:
א. למרבית המחלות הממאירות אין עדיין תרופה יעילה.
ב. התרופות אמורות להציל חיי אדם.
ג. יש נכונות לשלם סכומים גבוהים עבור התרופות.

1. זיהוי מולקולות מטרה ((target identification.
2. בחינת תקפות מולקולות המטרה  target validation) ).
3. קביעת המבנה התלת-ממדי (D3) של מולקולת המטרה.
4. הגדרת הדרישות – מה מצפים מה-leads, ובהמשך – מהתרופה.
5. בניית ספרייה אקראית של מולקולות העשויות לשמש כ-leads פוטנציאליים.
6. מציאתleads  (leads generation).
7. שיפור של ה-leads (leads optimization).
8. קביעה בפועל שה-leads תקפים (leads validation).
9. ניסויים פרה- קליניים (pre-clinical studies).
10. ניסויים קליניים.

בשלב הראשוני יש צורך לזהות מולקולת מטרה. מולקולת המטרה עשויה להיות חלבון תוך-תאי, אך יש העדפה למולקולת קולטן (receptor), אשר תתבטא באופן ייחודי על פני השטח של התאים מחוללי המחלה -(Tumor Associate Antigen) TAA, או, לחלופין, שמולקולת המטרה תתבטא ביתר (over expressed) על פני התאים מחוללי המחלה.

איתור מולקולת המטרה מתוך רצף הגנום האנושי מתבצע ע"י תוכנות ייחודיות ואמצעי מחשוב שפותחו לשם כך. שיטות אלה מאפשרות את תרגום רצף ה-DNA של הגנום לחלבונים שונים, שניתן לצפות כי יסונתזו בתאים השונים כתוצאה מ-alternative splicing קלאסי (כתוצאה מחיבורים אפשריים של exons שונים במולקולה הפוטנציאלית, כדוגמת הקולטןCD44  (ציור מס' 1).

אך ניתן גם לחזות את קבלתם של חלבונים נוספים (variants), מאותו רצף DNA, ע"י שיחבור של רצפי exons עם רצפי intron שלמים או חלקיים וקבלת מולקולות שאינן צפויות לפי מה שהיה מקובל ע"י alternative splicing קלאסי. תוכנות אלה חוזות למעשה את האפשרות שמולקולות מטרה כאלה אכן קיימות במציאות. אולם יש לאשש באמצעות ניסויי מעבדה שמולקולות אלה נוצרות במציאות (ציור מס' 1b).

קיימות מספר שיטות שבאמצעותן ניתן לוודא כי מולקולת מטרה ספציפית אכן מתבטאת על פני התאים מחוללי המחלה. באופן עקרוני ניתן להשתמש בתחלים (primers) ייחודיים בתהליך של (Polymerase Chain Reaction) PCR, תחלים שבאמצעותם ניתן לקבוע כי ה-mRNA הייחודי המקודד למולקולת המטרה אכן מתבטא בתאים ואף באיזו רמה. במקביל או לחלופין, ע"י שימוש בטכנולוגיה של Micro Array Chips, ניתן למצוא את עצם התבטאות מולקולת המטרה כחלבון. בשלב הבא יש לברר אם למולקולת המטרה יש קשר ישיר או נסיבתי לעצם היווצרות המחלה.

כאשר מזהים מולקולת מטרה, יש צורך לקבוע לגביה את המבנה התלת-ממדי(3 dimensional structure) . המבנה התלת-ממדי ניתן לחיזוי על סמך:

1. X-ray crystallography.
2. NMR Spectroscopy.
3. תוכנות המכנסות בתוכן קריטריונים כימיים, פיסיקליים ומתמטיים, המסוגלות לבצע3D modeling.
4. תוכנות הסורקות בנקי נתונים קיימים (Databank) לגבי מציאותן של מולקולות זהות (דומות), בהסתמך על הומולוגיות או אזורים משומרים (conserved domains). נתוני המבנה התלת-ממדי מאפשרים לחזות את מבנהו המרחבי של האתר הפעיל (active site) או המקטע המרחבי שאליו נקשר באופן הטבעי ה-ligand (pocket site””(. במידה שידוע ה-ligand הטבעי למולקולת המטרה הספציפית או שניתן לסרוק באמצעות תוכנות את בנק הנתונים לגבי ligands אפשריים על סמך הומולוגיה (קירבה), ניתן אזי ליצור מודל (site modeling) של אתר הקישור באחוזי ודאות גבוהים.

כאמור, מיפוי הגנום האנושי מאפשר את מציאתם של חלבונים חדשים העשויים לשמש כמולקולות מטרה, מולקולות שלא היו ידועות עד היום. תוכנות ואמצעי מחשוב שמרביתם מתבססים על הומולוגיות ואתרים משומרים, מאפשרים לחזות את פעילותם הביולוגית. בנוסף לכך, השימוש הנרחב ב-Micro Array chips מאפשר את מציאתן של אותן מולקולות המתבטאות ביתר (או באופן ייחודי) על פני תאים ממאירים.

החלבונים בטבע "משוחחים" בינם לבין עצמם ע"י קשרים כימיים ואלקטרוסטטיים, באמצעות אתרים ייחודיים הנמצאים עליהם. אתרים אלה עלולים לעבור שינויים במבנה התלת-ממדי שלהם, כתוצאה ממעבר סיגנלים שונים בין התאים (או בתוך התא עצמו) או כתוצאה משינויים פיסיולוגיים, וכן מהפיכת התא הבריא לממאיר. בנוסף לכך, אתרי "השיחה" בין החלבונים יכולים להיות מורכבים מרצף ישיר של חומצות אמיניות (linear epitopes), מהיווצרות מבנה שאינו נובע מרצף ישיר של חומצות אמיניות אלה מהתקפלות במרחב (conformational epotope), או ממציאותן של שרשראות צדדיות הנובעות מהיווצרות מודיפיקציות, כגון הוספת שיירים סוכריים (glycosylation), הוספת קבוצות פוספט (phosphorylaiton) וקבוצות מתיליות (methylation). מודיפיקציות אלה יכולות לגרום לחלבון לשנות את מסיסותו, מבנהו המרחבי, זמן מחצית-החיים שלו בזרם הדם, מידת האימונוגניות שלו, ולעתים אף את תפקודו הביולוגי.

התוכנות ואמצעי המחשוב העדכניים עדיין מתקשים לחזות (ליצור מודל) כיצד ייראה האתר הפעיל או אתר הקישור של מולקולת מטרה כתוצאה מהמודיפיקציות הנ"ל. לכן, התכנון של מולקולות התרופה אינו בהכרח מדויק ויש צורך לוודא בפועל שה-leads הפוטנציאליים אכן עונים בפועל על המטרות שהוגדרו בתחילת התכנון.

על סמך בניית מודל ה-3D ניתן לגשת לתכנון התרופה. בשלב ראשון יש צורך בהגדרה מדויקת של מאפייני המולקולה אותה אנו מתכננים (custom design). אנו מצפים:

1. למולקולה שתהיה בעלת זיקה למולקולת המטרה ותשמש כמעכב ע"י התקשרותה (מולקולה שתמנע את קישור ה-ligand הטבעי וכתוצאה מכך פעילות ביולוגית מסוימת).
2. למולקולה שתהיה בעצמה בעלת פעילות ביולוגית המדמה את זו של ה-ligand הטבעי (החסר או הפגום בתאי החולה).
3. למולקולה בעלת זיקה חזקה למולקולת המטרה, שבעצם התקשרותה תגרום להרס (lysis) של התאים מחוללי המחלה המבטאים את מולקולות המטרה.
4. למולקולה בעלת זיקה חזקה וספציפית למולקולת המטרה, שתשמש לביות (targeting) של תרופות אחרות (גנריות), אשר יגרמו להרס התאים מחוללי המטרה (בכדי לשפר את יעילותם, להפחית תופעות לוואי ולהוריד את המינון האפקטיבי).

המולקולות המתוכננות כתרופה יכולות להיות תרכובות כימיות (chemical entities) שיילקחו ע"י החולים באופן פומי ועברו דרך מערכת העיכול (oral delivery), או מולקולות אשר יוזרקו לשריר או ישירות לזרם הדם. לחלופין, המולקולות עשויות להיות פפטידים קצרים ליניאריים או ציקליים, יותר עמידים בזרם הדם לפירוק (דגרדציה) ולכן בעלי זמן מחצית חיים ארוך יותר, או אפילו נוגדנים חד-שבטיים. במאמר זה נתמקד בתכנון תרופות שהן מולקולות כימיות, למרות שגם נתאר בקצרה תכנון תרופות המושתת על פפטידים ונוגדנים חד-שבטיים אנושיים.

הערה: למולקולות כימיות כתרופה יש יתרונות משמעותיים על מולקולות פפטידים או נוגדים אנושיים חד-שבטיים:

• קלות הסינתזה בכמויות גדולות.
• הזמן הקצר יחסית הדרוש לפיתוח דור שני (second generation).
• אופן מתן התרופה: במרבית המקרים המתן הוא פומי, בעוד שבפפטידים ונוגדנים במרבית המקרים המתן הוא IV.
• פשטות/קלות רבה יותר מבחינה רגולטורית בהגשת התיקים לרשויות הבריאות.
• עלויות ייצור נמוכות יותר.
• בקרה מדויקת יותר על המינון.

ברגע שנקבע המבנה התלת-ממדי (D3) של האתר הפעיל (או אתר הקישור) במולקולת המטרה, ניתן באמצעות תוכנות מתאימות להתחיל בסריקה לצורך זיהוי leads פוטנציאליים. הנחת העבודה היא שהמבנה התלת-ממדי של מולקולת המטרה, בהיותה בתמיסה בתוך התא או בהיותה מקופלת ומוצגת על פני השטח של  התא – זהה. הנחת העבודה גם מביאה בחשבון שהמבנה התלת-ממדי הנ"ל יהיה גם המבנה בפועל, כאשר מולקולת ה-ligand תהיה קשורה אליו. הסריקה הראשונית יכולה להיעשות על ספרייה כימית וירטואלית (אין סוף מולקולות כימיות), או על ספריות כימיות ממשיות הקיימות בחברת התרופות שבה נעשה הפיתוח, או, במידה שיש נגישות לכך, על ספריות כימיות קיימות אחרות בבנקי נתונים מתאימים (ספרייה כימית קיימת מכילה בממוצע כ-107 מולקולות כימיות שונות).

המולקולות הכימיות המתוכננות חייבות גם לתת מענה לבעיות של מסיסות בזרם הדם, עמידות לפירוק בתוך זרם הדם, פרמקוקינטיקה סבירה, אשר יחד עם חוזק הזיקה למולקולת המטרה יהיו בין הגורמים שיקבעו את המינון (dosing), ספיחה לא ספציפית למולקולות בזרם הדם כדוגמת serum albumin, וכן את רעילותן. במידה שהמולקולה מתוכננת לפעולה תוך-מוחית, יש צורך לתכנן מראש ספרייה של מולקולות כימיות שלהן יכולת חדירה מזרם הדם אל המוח. המולקולות הקיימות בספרייה מתאימות פוטנציאלית למבנה התלת-ממדי של מולקולת המטרה מבחינת המבנה המרחבי, המטענים החשמליים, הקשרים הכימיים וכו'.

הערה: במרבית התוכנות, כאשר נקבע המבנה התלת-ממדי (D3) של מולקולת המטרה, הוא נשמר לאורך כל משך הסריקה הווירטואלית כמבנה קשיח (rigid), בעוד שלגבי המולקולות הפוטנציאליות הנסרקות מאפשרת התוכנה יתר גמישות (flexibility). קיימות גם תוכנות המבצעות את תכנון מולקולות ה-leads, כאשר הן אינן מהוות מולקולה שלמה אלא ע"י הרכבתן כפאזל ממקטעים (fragment-positioning method). בתכנון מעין זה בודקים התאמות של חלקי מולקולה לחלק מאתר הקישור במולקולת המטרה, ע"י תוכנות המחשבות יכולת עיגון (docking), תוך ביצוע ניקוד מתמיד (score) לגבי מידת ההתאמה (ציור מס'  3 ). בסופו של דבר, בהליך זה נבנית מולקולת הליגאנד (leads) מחלקים (fragments), שלהם גמישות יחסית גבוהה לנוע במרחב ולמצוא את ההתאמה הטובה ביותר לאתר הפעיל (ציור מס' 3).

מתוך מכלול המולקולות בספרייה, הנמצאות מתאימות לקריטריונים אלה, ישנה תוכנה הבודקת למי מתוכן יש את ה-best fitness and function. על הטכנולוגיה להיות מסוגלת לתת מענה לשאלה – איזו מולקולה, מתוך שתי מולקולות מתוכננות וירטואלית, עדיפה. למעשה, התוכנה יוצרת בתחילה אוסף אקראי של מולקולות כימיות העשויות להוות פתרון לבעיה כפי שהוגדרה. המערכת בודקת וירטואלית את מידת התאמתן (ע"י כך שהיא משווה בין מולקולה אחת לאחרת) ויוצרת מתוכן ע"י הכלאה מולקולות "חדשות" וירטואליות עם התאמה משופרת. לבסוף היא מציינת מספר קטן של מולקולות leads, שאותן היא ממליצה לסנתז בפועל לצורך בדיקת היתכנות לתפקוד בפועל.

לעתים המבנה התלת-ממדי אינו ידוע או שמידת הוודאות לגביו נמוכה. כמו כן, גם כאשר נקבע באמצעות התוכנה המבנה התלת-ממדי, ישנם מקרים בהם מבצעים סריקה בפועל באמצעות ספריות אקראיות -combinatorial libraries (ספריות כימיות, ספריות של פפטידים או ספריות של נוגדנים אנושיים חד-שבטיים, ספריות שעקב מגבלות טכנולוגיות מכילות כל אחת כ-107 מולקולות שונות). לשם ביצוע סריקה בפועל (high throughput screening), יש הכרח לפתח תהליך זיהוי מהיר ופשוט (simple read out assay), שבמרבית המקרים מתבצע בפלטות המכילות 96 או 384 בארות ומבוסס על היווצרות ריאקצית צבע או של חומר פלואורסצנטי.

מידת רגישות ה-assay ואמינותו קובעת למעשה את טיב ה-leads שיתקבלו. בסריקות אקראיות עם ספריות כימיות, פפטידים או חלבונים, מקבלים בסוף התהליך 8-15 leads פוטנציאליים, שאותם יש צורך לבדוק בהמשך בהליך של lead validation. גם כאן מרבית ה-leads הם ראשוניים ויש הכרח בהמשך לבצע lead optimization.

תהליך ה-lead optimization של מולקולות leads ראשוניות, שמקורן בסריקה וירטואלית או בסריקה בפועל של ספריות חומרים כימיים לאחר שעברו את שלב ה-lead validation – זהה (אין הבדל אם ה-leads נתקבלו כפרי תכנון על פי המבנה התלת-ממדי או ע"י סריקה בפועל על סמך functional readout assay ). על סמך סדרת מולקולות ה-leads שנתקבלו, שלגביהן נקבעו בפועל הזיקה ומידת הספציפיות למולקולת המטרה, ניתן לבצע תכנון תרופה מחודש, ע"י הכלאתן של מולקולות ה-leads בינן לבין עצמן (cross over method). בתהליך ההכלאה נוטלים חלקים ממולקולת leads אחת ומשחלפים אותה עם מולקולות leads אחרות, ובודקים האם שינוי זה ישפר את הזיקה או את הספציפיות או את שניהם גם יחד. התוכנה מבצעת best fitness and function במטרה לקבל מולקולות leads משופרות, שמתוכן ייבחרו המולקולות הסופיות לצורך פיתוח.

ה-lead optimization של מולקולות leads, שמקורן בפפטידים או בנוגדנים חד-שבטיים – זהה. על סמך ה-leads הראשוניים שנבדקו בתהליך של ה-lead validation, בודקים האם יש בין ה-leads הנ"ל אזורי קונצנזוס, או שניתן לבדוק לפיהם בתוכנות המתאימות כיצד נעשה ה- dockingלאתר הפעיל (או אתר הקישור) במולקולת המטרה, לפי המבנה התלת-ממדי של האתר הנ"ל.

לדוגמה: ספריות הפפטידים הן באורך של כ-12-14 חומצות אמיניות אקראיות. כאשר מתקבלים ה-leads הראשוניים, בודקים דמיון וקונצנזוס אפשרי ביניהם (ציור מס'  4).

לדוגמה: רצף חומצות אמיניות של 8 פפטידים, leads ראשוניים באורך של 12 חומצות אמיניות. ניתן לראות כי במקומות 9,8,5,2,1 ו-12 ישנן חומצות אמיניות החוזרות במקומות אלה על עצמן במרבית ה- leads, ולכן מקיימות קונצנזוס.

ניתן לכן להכין ספרייה חדשה שניונית של כ-106 מולקולות חדשות שונות, שבה בכל מקום X יוכנסו באופן אקראי כל אחת מתוך 22 החומצות האמיניות השונות, בעוד שהמקומות המסומנים באדום יישארו קבועים. באמצעות הספרייה השניונית מבצעים סריקה מחודשת של מולקולת המטרה ומזהים את ה-leads המשופרים (בעלי זיקה וספציפיות טובים יותר).

R – Arginine
A – Alanine
P – Proline
T – Threonine
L – Leucine
G – Glycine
F – Fenyl alanine
S – Serine
K – Lysine
D – Aspartic
I – Isoleucine
E – Glutamic
M – Mehionine
C – Cysteine

כאשר מסנתזים בפועל את ה-leads הפוטנציאליים יש הכרח לבדוק אותם הן במעבדה במערכות ביולוגיות תאיות in vitro, והן במודלים של חיות ניסיון in vivo. מולקולות ה-leads נבדקות באשר למידת התאמתן להגדרות ולאפיונים שנקבעו מראש לגבי הדרישות המתוכננות לתרופה. במרבית המקרים מסתבר, כי ה-leads הנ"ל הם leads ראשוניים, ולמרות שהם נקשרים למולקולת המטרה ואף מבצעים את הפעילות הביולוגית שתוכננה להם, יש עדיין מקום למקצה שיפורים (leads optimization).

במרבית המקרים אין ל-leads זיקה מספקת למולקולת המטרה ויש צורך לשפר בכמה סדרי גודל (פי מאה ומעלה) את עוצמת הזיקה. בנוסף לכך, בחלק גדול מהמקרים אין ל-leads בשלב זה ספציפיות מספקת והם נקשרים גם למולקולות מטרה אחרות, ולכן סביר להניח כי יגרמו לתופעות לוואי.

את ה-leads המשופרים (בתום ה-lead optimization) יש לבדוק בסדרה של ניסויים ביולוגיים in vitro ובמודלים של המחלה בחיות ניסוי in vivo, במטרה לבדוק את יעילותם במערכות ניסיוניות המדמות ככל האפשר את המחלה המתפתחת באדם. בניסויים אלה רצוי לקבל את מרב הנתונים לגבי הנקודות הבאות:

• עוצמת זיקה.
• ספציפיות זיקה.
• קישור בלתי ספציפי לתאים ולרקמות בריאות.
• יציבות בזרם הדם.
• זמן מחצית חיים בזרם הדם.
• רעילות.
• תופעות לוואי צפויות.
• יעילות המולקולות במניעת המחלה.
• מינון צפוי בבני אדם.

על סמך הנתונים שמתקבלים מניסויים אלה בוררים 2-3 מולקולות leads סופיות, שאותן בודקים בניסויי טוקסיקולוגיה.

בהמשך, ביצוע הניסויים הקליניים בבני אדם אינו שונה מכל הניסויים הקליניים האחרים שמתבצעים לצורך אישור תרופה חדשה ע"י רשויות הבריאות.

כיום נמצאות מספר מולקולות כימיות בניסויים קליניים phase I וכן phase II, שפותחו בארבע-חמש השנים האחרונות באמצעות תוכנות של drug design. עדיין מוקדם לקבוע אם מולקולות אלה יעברו בהצלחה את כל שלבי האישור של רשויות הבריאות.

הכותב ד"ר אביגדור לבנון- לשעבר סמנכ"ל למחקר, ביוטכנולוגיה כללית (ישראל) בע"מ, קרית ויצמן, רחובות